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Woolrich Sale die Durchführung einer einzigen 6xHis Schwanz

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2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase (2,3-DBPD) ein Extradiol artigen Dioxygenase, die den aromatischen Ringspaltung von 2,3-Dihydroxybiphenyl, der dritte Schritt im biphenyl Abbauweg katalysiert. Die Nukleotidsequenz des Pseudomonas putida OU83 Gen bphC, die 2,3-DBPD kodiert, wurde in ein Plasmid pQE31 geklont. Das His-markierten 2,3-DBPD durch einen rekombinanten Escherichia coli-Stamm, Woolrich Sale SG13009 (pREP4) (pAKC1) produziert und mit einem gereinigten Ni-Nitrilotriessigsäure Harzaffinitätssäule unter Verwendung des His-Bind-Qiagen-System. Das His-markierte 2,3-DBPD Aufbau, die Durchführung einer einzigen 6xHis Schwanz auf dem N-Terminus des Polypeptids, aktiv war. SDS-PAGE-Analyse das gereinigte aktive 2,3-DBPD ergab eine einzelne Bande von 34 kDa; .. das ist in Übereinstimmung mit der Größe des bphC kodierende Region Die Km für 2,3-Dihydroxybiphenyl war 14,5 ± Woolrich Jacken München 2 uM Die Enzymaktivität wurde durch Eisen verbessert Ionen hemmte jedoch von Eisenion. Die Enzymaktivität wurde durch thiol-blockierende Reagenzien und Schwermetalle HgCl2, CuSO4, NiSO4 und CdCl2 gehemmt. Die Ausbeute war viel höher, und die erforderliche Woolrich Winter 2014 Zeit, um rekombinante 2,3-DBPD aus Klon pAKC1 reinigen war schneller als durch die herkömmlichen Chromatographieverfahren.
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